Внедрение технологий массового параллельного секвенирования (MPS) в клиническую практику требует разработки экономически эффективных и воспроизводимых протоколов пробоподготовки. Использование Tn5-транспозазы для подготовки ДНК-библиотек позволяет совместить фрагментацию ДНК и лигирование адаптеров в одной реакции, что сокращает время и количество необходимых этапов по сравнению со стандартными методами с ультразвуковой фрагментацией.
Исследование проводили на геномной ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови человека. Пре-библиотеки получали методом тагментации с использованием набора SyntEra-DNA на основе Tn5-транспозазы. Обогащение целевых регионов гена EGFR осуществляли путём двухраундовой гибридизации со специально подобранным пулом биотинилированных зондов с последующим захватом на стрептавидиновых магнитных частицах. Секвенирование обогащённых библиотек выполняли на платформе Illumina MiSeq. В качестве референсных технических данных использовали показатели секвенирования ранее полученных ДНК-библиотек, подготовленных с применением коммерческого набора SureSelectXT.
Разработанный протокол позволил получить ДНК-библиотеку со средней длиной фрагментов около 300 п.н. и концентрацией, достаточной для секвенирования. Доля целевых оснований гена EGFR с покрытием выше 10× достигала 98%, а доля с покрытием не менее 20× была 96%. Доля оснований, попавших в целевые регионы, составила 87%. Значение Fold-80 base penalty составило 1,5, что свидетельствует о равномерном покрытии целевой области.
Предложенный протокол на основе Tn5-транспозазы и отечественных реагентов позволил получить ДНК-библиотеку, пригодную для таргетного MPS, и подтверждает принципиальную применимость разработанного подхода для эффективного обогащения целевых регионов.